آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography)یکی از روش‌های مهم در علم شیمی است که برای جداسازی، شناسایی و اندازه گیری مقادیر کم از مواد مورد استفاده قرار می‌گیرد. اولین بار روش‌های کروماتوگرافی (کروم به معنی رنگ و گراف به معنی ترسیم) توسط تسوت گیاه شناس روسی که بر روی جداسازی رنگدانه‌های برگ سبز کار می‌نمود، شناخته شد. این روش از جمله تکنیک‌های جداسازی مرسوم است، که در بسیاری از علوم بکار برده می‌شود که بی تردید، سریع‌ترین رشد را در بین تمام روش‌های جداسازی تجزیه‌ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دلار داشته است. دلایل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌گیری‌های کمی دقیق، قابلیت آن برای جداسازی مواد و گونه‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم‌تر از همه، کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت، زمینه‌های مختلفی علوم و جامعه اهمیت بالایی دارندبه نتایج حاصل از دستگاه HPLC کروماتوگرام گفته می شود.

اجزاء و قسمت‌های مختلف دستگاه HPLC

دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت‌های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می‌شود:
1- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلال‌های شستشودهنده ستون ریخته شده است.
2- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می‌شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می‌گردد.
3- تزریق‌کننده: تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می‌گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می‌گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را می‌دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می‌شود. در روش دستی، از سرنگ‌هایی با ظرفیت‌های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می‌شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه‌بردار بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می‌شود.
4- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش‌ستون یا محافظ ستون می‌شود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی‌متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده‌ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده و به ستون اصلی آسیب نمی‌زند. ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. جنس ستون‌ها از فولاد ضدزنگ است.
5- آشکارساز:آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می‌شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی‌های زیر باشد:
• حساسیت بالا
• قادر به اندازه گیری مقادیر ناچیز نیز باشد.
• باید سریعا به پیک‌های باریک که از درون سلول به سرعت عبور می‌کنند به طور صحیح واکنش نشان دهد.
• باید محکم، ارزان قیمت و تنظیمات آن ساده باشد.

در ادامه به تعدادی ازآشکارسازهای مرسوم اشاره می‌شود:
الف-آشکارسازUV-Vis :در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت، غلظت نمونه اندازه‌‌گیری می‌شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می‌شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می‌بایست مد نظر قرار بگیرد. در طول موج انتخابی، نباید مزاحم‌های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.
ب- آشکارساز فلورسانس:حساس‌تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند.
ج -دتکتورPDA:دتکتورPDAدستگاه HPLC امکان تشخیص درکل طیف را به صورت همزمان فراهم می آورد. آشکار سازهای UV و Vis دستگاه HPLC نتایج را بر اساس دو بعد زمان و شدت نور تعیین می کنند، در حالی که دتکتور PDA بعد سوم طول موج را نیز اضافه می کند. استفاده از دتکتور PDA در کروماتوگرافی مایع، امکان تعیین مناسب ترین طول موج، بدون تکرار آنالیز را به راحتی فراهم می آورد.
د- آشکارساز ضریب شکست:اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می‌شود. پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولا به ندرت ازآن استفاده می‌شود. این آشکار ساز عمومی بوده و برای ترکیباتی که در UV-Vis و فلورسانس جذب ندارند، مثل قندها به کار می رود.
ه-آشکارساز طیف‌سنج جرمی :این مورد امروزه به دلیل مزایای زیادی که دارد به طور وسیعی مورد استفاده قرار می‌گیرد. از این جمله می‌توان به حد تشخیص بسیار پایین، حساسیت و انتخابگری بالا و امکان بررسی نمونه در حضور مزاحم‌های شیمیایی اشاره کرد.
در صورتی که از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق‌سازی (ایجاد تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این آشکارسازهای ذکر شده استفاده می‌شود. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه‌گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روش‌های دیگر و آشکارسازهای پیشرفته‌ای مانند طیف‌‍ سنج جرمی کاربردهای زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسبHPLC است.