آزمایش باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی
باکتری‌ها بر اساس ساختار دیواره سلولی خود به دو دسته گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند. این تفاوت در ساختار، باعث واکنش‌های متفاوت در برابر رنگ‌آمیزی گرم می‌شود که یک روش مهم در شناسایی و تشخیص باکتری‌ها است.
تفاوت‌های اساسی بین باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی:
- دیواره سلولی:
- گرم مثبت: دارای یک لایه ضخیم پپتیدوگلیکان (Peptidoglycan) است که حدود 60-90% وزن خشک دیواره سلولی را تشکیل می‌دهد.
- گرم منفی: دارای یک لایه نازک پپتیدوگلیکان (حدود 5-10% وزن خشک دیواره سلولی) است که بین دو غشاء سیتوپلاسمی داخلی و خارجی قرار دارد. غشاء خارجی حاوی لیپوپلی‌ساکارید (LPS) است که یک اندوتوکسین قوی است.
- رنگ‌آمیزی گرم:
- گرم مثبت: پس از رنگ‌آمیزی گرم، به رنگ بنفش تیره یا آبی دیده می‌شوند.
- گرم منفی: پس از رنگ‌آمیزی گرم، به رنگ صورتی یا قرمز دیده می‌شوند.
آزمایش رنگ‌آمیزی گرم (Gram Staining):
رنگ‌آمیزی گرم یک روش افتراقی است که برای تشخیص و شناسایی اولیه باکتری‌ها استفاده می‌شود. این روش بر اساس تفاوت در ساختار دیواره سلولی باکتری‌ها عمل می‌کند.
هدف از انجام آزمایش رنگ‌آمیزی گرم:
- شناسایی و طبقه‌بندی اولیه باکتری‌ها
- کمک به تشخیص عفونت‌های باکتریایی
- تعیین نوع آنتی‌بیوتیک مناسب برای درمان عفونت
مراحل آزمایش رنگ‌آمیزی گرم:
- تهیه نمونه:
- ابتدا یک نمونه از باکتری‌ها (مانند کشت باکتری، نمونه بالینی) بر روی یک لام شیشه‌ای تمیز قرار دهید.
- اجازه دهید نمونه در هوا خشک شود.
- نمونه را با حرارت ملایم (Heat Fixation) تثبیت کنید تا به لام بچسبد. این کار با عبور دادن لام از روی شعله به مدت کوتاه انجام می‌شود.
- رنگ‌آمیزی:
- رنگ‌آمیزی اولیه (Primary Stain): لام را با کریستال ویوله (Crystal Violet) به مدت 1 دقیقه بپوشانید. سپس لام را با آب مقطر بشویید. کریستال ویوله به تمام سلول‌ها نفوذ می‌کند و آن‌ها را به رنگ بنفش در می‌آورد.
- تثبیت رنگ (Mordant): لام را با لوگول (Lugol’s Iodine) به مدت 1 دقیقه بپوشانید. سپس لام را با آب مقطر بشویید. لوگول به عنوان یک ماده تثبیت‌کننده عمل می‌کند و با کریستال ویوله کمپلکس تشکیل می‌دهد، که باعث افزایش اندازه مولکول‌های رنگ می‌شود و از خروج آن از دیواره سلولی جلوگیری می‌کند.
- رنگ‌زدایی (Decolorization): لام را با الکل استون (Alcohol-Acetone) به مدت 15-30 ثانیه بشویید. این مرحله بسیار حیاتی است. الکل استون باعث حل شدن چربی‌های غشاء خارجی باکتری‌های گرم منفی می‌شود و کمپلکس کریستال ویوله-ید را از دیواره سلولی آن‌ها خارج می‌کند. در حالی که در باکتری‌های گرم مثبت، به دلیل وجود لایه ضخیم پپتیدوگلیکان، رنگ به دام می‌افتد و خارج نمی‌شود.
- رنگ‌آمیزی متقابل (Counterstain): لام را با سافرانین (Safranin) به مدت 1 دقیقه بپوشانید. سپس لام را با آب مقطر بشویید و خشک کنید. سافرانین یک رنگ با بار مثبت است که سلول‌های بی‌رنگ گرم منفی را به رنگ صورتی یا قرمز در می‌آورد. باکتری‌های گرم مثبت که قبلاً با کریستال ویوله رنگ‌آمیزی شده‌اند، تحت تأثیر سافرانین قرار نمی‌گیرند.
- مشاهده:
- لام رنگ‌آمیزی شده را زیر میکروسکوپ با عدسی روغنی (Oil Immersion Lens) مشاهده کنید.
- باکتری‌های گرم مثبت به رنگ بنفش تیره یا آبی و باکتری‌های گرم منفی به رنگ صورتی یا قرمز دیده می‌شوند.
تجهیزات و وسایل مورد نیاز:
- لام شیشه‌ای
- میکروسکوپ
- پیپت
- ارلن مایر یا بشر
- آب مقطر
- کریستال ویوله
- لوگول
- الکل استون
- سافرانین
- روغن ایمرسیون
- چراغ بونزن یا حرارت دهنده
- جا لام